Wstern blot

(SDS-PAGE는 다음에 따로 다룰 예정)

 

◎ 주요 개념

- antibody를 넣을 땐 skim milk와 같은 buffer에 dilution시켜 사용(blokcing과 혼동하지 말것)

- blocking : skim milk등을 이용하는데, confirm하고자 하는 protein을 제외한 나머지 부분에 blocking solution의 protein을 이용하여 빈자리를 매움으로써 antibody가 다른 곳에 붙는 것을 방지

- antibody : 보통 rabbit과 mouse로부터 얻음 1st antibody는 target protein에 결합하도록 design되어야 하며, 2nd antibody는 1st antibody와 결합하는 동시에 끝에 HRPO등의 형광물질이 있어서 나중에 detect할 수 있어야 함

- ECL kit의 경우 femto와 pico 단위의 sensitivity를 구분하여 사용

 

◎ 프로토콜 및 코멘트

1. Cell lysis : tube 내의 protein 중 tag를 이용하여 selecting이 가능하지만, 좀 더 높은 step이고, 보통은 cell lysis 이후에 soluble한 부분만 빼내어 바로 PAGE실시

2. PAGE : polyacrylamide 이용, protein의 charge(-)를 이용, gel에서 크기별로 나눈다. 이 때 gel은 stacking gel(ph 6.8)과 seperation gel(ph 8.8)로 나눌 수 있으며, stacking gel을 통해 protein을 압축시켜 정확한 분리가 가능하게 한다.

3. Gel에 membrane을 맞닿게 하고 전기를 걸어줘서 transfer

4. Blocking : 단백질 사이의 빈 공간을 skim milk내의 단백질을 이용하여 막음

5. 1st antibody(by mouse) : 해당 protein에 binding하는 antibody를 이용, 비슷한 상동성을 가진 단백질의 경우에도 붙기 때문에 purity는 떨어진다. (FLAG를 이용한 경우 antibody의 specific을 많이 높일 순 있다.)

6. TBST로 wash : 보통 2~3회, 5~10min 주기

7. 2nd antibody(by rabbit, +HRPO) : 1st antibody의 heavy chain에 결합, 형광물질인 HRPO를 가지고 있음

8. TBST로 wash : 5min 간격으로 4번 정도

9. ECL kit 첨가 : HRPO가 빛을 내도록 함. A, B solution으로 나누어져 있으며 각각 루미놀과 과산화수소(H2O2)를 가진다. A:B=1:1 비율로 filter가 잠길 정도로 넣는다. pico 단위와 femto단위로 종류가 나누어져 있으며 femto단위가 더 작은 양으로도 dictection이 가능하다.

10. filter를 cassette에 끼우고, X-RAY film을 가지고 암실로 가서 film을 filter위에 올려 감광한다. (1sec, 15sec, 30sec) : filter는 건조되선 안되며, X-RAY film은 빛에 노출되어서는 안되므로 암실에 들어갈 땐 항상 문단속을 하고, 빛을 차단하여야 한다.